Projet: Décrypter les mécanismes moléculaires de la distribution du phosphatidylinositol
Présentation
Le phosphatidylinositol (PI) est un lipide unique car il est le précurseur des phosphoinositides, comme le PI4P et PI(4,5)P2, qui ont des rôles clés dans la cellule eucaryote. Néanmoins, la façon dont le PI est exporté du réticulum endoplasmique (RE) où il est fabriqué, vers l’appareil de Golgi et la membrane plasmique pour être converti en phosphoinositides, reste méconnue. Différentes protéines, capable de transférer du PI entre membranes, pourraient assurer cette tâche mais ceci est mal établi.
Avec ce projet, nous voulons montrer que certaines d’entre-elles, Sec14, PITPα et PITPβ, couplées au métabolisme de PI4P, et à d’autres processus d’échange de lipides, peuvent transférer du PI du RE vers l’appareil de Golgi. Ensuite, nous établirons de quelle manière la protéine Nir2 peut assurer des échanges rapides et soutenus de PI et d’acide phosphatidique entre le RE et la membrane plasmique lors du cycle du PI, un processus métabolique permettant de régénérer du PI(4,5)P2 pour maintenir les fonctions de signalisation des cellules humaines. Enfin, nous définirons si Sfh3 est un échangeur stérol/PI et quelle est sa fonction dans la levure, en révélant sans doute des liens inattendus entre métabolisme du PI et du stérol.
Notre équipe a reconstitué in vitro une interface RE/appareil de Golgi, et mesuré le couplage entre l’activité d’une protéine de transfert de PI, le métabolisme du PI4P et un processus d’échange stérol/PI4P. En développant ce système et des approches de click-chemistry avec des lipides synthétisés par l’équipe de JM Brunel (MCT, Marseille), nous démontrerons comment les protéines de transfert de PI peuvent fonctionner à l’interface entre le RE et d’autres organites. Avec A. Copic (CRBM), nous étudierons ces protéines dans les cellules humaines et de levure, avec des outils récents pour détecter le PI dans les organites. Ainsi nous apporterons des données inédites sur les bases moléculaires de la distribution du PI dans la cellule eucaryote.
(A) Transfert de déhydroergostérol (DHE), un stérol fluorescent, via des échanges stérol/PI4P médiés par Osh4, entraînés par un gradient de concentration de PI4P généré par une PI 4-kinase à partir de PI et d’ATP et de Sac1 qui hydrolyse PI4P en PI. Des liposomes imitant le réticulum endoplasmique (ER-like) contenant DOGS-NTA-Ni2+ et recouverts de Sac1[1-522]His6 ont été ajoutés à une quantité égale de liposomes de type Golgi enrichis en PI et recouverts de PI4K. Ensuite, Osh4, seul ou avec de l’ATP, a été injecté. Un signal FRET DHE/DNS-PE (courbe bleue) montre que Osh4 transfère activement du DHE aux liposomes de type Golgi lorsque le PI4P est synthétisé et dégradé. (B) Des liposomes de type Golgi recouverts de PI4K ont été mélangés à des liposomes de type ER contenant du PI. L’ajout de l’échangeur PC/PI Sec14 en présence d’ATP (courbe rose) a permis de mesurer l’apparition de PI4P à la surface des liposomes de type Golgi à l’aide d’un capteur fluorescent NBD-PHFAPP, indiquant que Sec14 peut transporter le PI des liposomes de type ER aux liposomes de type Golgi. (C) Des liposomes de type ER contenant du DHE et du PI décorés de Sac1[1-522]His6 ont été ajoutés aux liposomes de type Golgi fonctionnalisés par PI4K. Ensuite, Osh4 et ATP, avec ou sans Sec14, ont été injectés. Le transport actif de DHE est mesuré uniquement en présence d’ATP, indiquant que Sec14 transporte le PI vers la PI 4-kinase, permettant ainsi les échanges stérol/PI4P par Osh4.